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小鼠β-連環蛋白(β-catenin)ELISA試劑盒使用說明書

  • 所屬分類:應用方法

    上傳時間:2017/10/10

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資料簡介

小鼠β-連環蛋白(β-catenin)ELISA試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用目的:本試劑盒用于測定小鼠血清,血漿及相關液體樣本中小鼠β-連環蛋白(β-catenin)含量。

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本小鼠β-連環蛋白(β-catenin水平。用純化的小鼠β-連環蛋白(β-catenin抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入β-連環蛋白(β-catenin),再與HRP標記的羊抗鼠抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過徹底洗滌后底物TMB顯色。TMBHRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的β-連環蛋白(β-catenin呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品小鼠β-連環蛋白(β-catenin濃度。

試劑盒組成

試劑盒組成

48孔配置

96孔配置

保存

說明書

1

1

 

封板膜

2片(48

2片(96

 

密封袋

1

1

 

酶標包被板

1×48

1×96

2-8℃保存

標準品:270pg/ml

0.5ml×1

0.5ml×1

2-8℃保存

標準品稀釋液

1.5ml×1

1.5ml×1

2-8℃保存

酶標試劑

3 ml×1

6 ml×1

2-8℃保存

樣品稀釋液

3 ml×1

6 ml×1

2-8℃保存

顯色劑A

3 ml×1

6 ml×1

2-8℃保存

顯色劑B

3 ml×1

6 ml×1

2-8℃保存

終止液

3ml×1

6ml×1

2-8℃保存

20倍濃縮洗滌液

20ml×1

30ml×1

2-8℃保存

 

樣本處理及要求

1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清,保存過程中如出現沉淀,應再次離心。

2. 血漿:應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應該再次離心。

3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時,用PBSPH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100/ml左右。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBSPH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但避免反復凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

操作步驟

1. 標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設標準品孔10孔,在第一、第二孔中分別加標準品100μl,然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μl,混勻;然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,再各取50μl分別加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul,混勻;混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl,混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl,濃度分別為180pg/ml,120pg/ml ,60pg/ml,30pg/ml ,15pg/ml)。

2. 加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。

3. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4. 配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。

5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。

6. 加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。

7. 溫育:操作同3。

8. 洗滌:操作同5。

9. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘. 

10. 終止:每孔加終止50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。

11. 測定:以空白空調零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

注意事項:

1. 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。

2. 濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。

3. 各步加樣均應使用加樣器,并經常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內,如標本數量多,推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時做標準曲線,最好做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(n倍)后再測定,計算時請最后乘以總稀釋倍數(×n×5)。

5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

6. 底物請避光保存。

7. 嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

8. 所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9. 本試劑不同批號組分不得混用。

10. 如與英文說明書有異,以英文說明書為準。


計算

以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,    

在坐標紙上繪出標準曲線,根據樣品的OD      

值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋      

倍數;或用標準物的濃度與OD值計算出標      

準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD      

代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋      

倍數,即為樣品的實際濃度。                  

標準曲線圖   
(此圖僅供參考) 

 

試劑盒性能:

1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990以上。

2.批內與批見應分別小于9%11%

 

檢測范圍:                                              

10pg/ml - 200pg/ml                                         

                            

保存條件及有效期:

1.試劑盒保存:;2-8。

2.有效期:6個月

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