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免疫組化實驗代測應用廣泛,信帆生物值得您的新信賴!

提供者:上海信帆生物科研所   發布時間:2019/11/28  閱讀次數:42次   進入該公司展臺

免疫組化實驗代測應用廣泛,信帆生物值得您的新信賴!

 

實驗技術簡介:

免疫組化是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應,即抗原與抗體特異性結合的原理,通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內抗原(多肽蛋白質),對其進行定位、定性及定量的研究,稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。

免疫組化(IHC)技術通過計分法或灰度計量法也可以反應抗原的表達量,但其特點在于切片制作過程中保持組織、細胞的原有結構及形態,因此可以反應目標抗原在組織結構中的分布以及亞細胞定位。組織細胞定位往往是生理功能發揮或變化的體現,是研究中常常關注的因素。

 

免疫組化主要步驟:

1.洗載玻片: 將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目的是為了是載玻片上的硅膠等除去,同時使一些肉眼看不見的凹凸不平的表面變平整,便于組織吸附,然后置于清水中清洗,除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個小時左右),再將載玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C溫箱中,將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面,由于Lys帶正電,而大多數的組織帶負電荷,從而產生吸附作用。
2.包埋組織: 先在鐵模具中加入一些液態石蠟,先稍微冷卻,然后再將待包埋的組織置于石蠟之中,并排列整齊,再將塑料模具盒蓋上,最后加入少許液體石蠟,進行冷凍,使石蠟變成固態。
3.切片:將包埋好的組織從模具上取下來,并置于石蠟切片機上,切片機通過調節上下左右來來使組織和切割方向一致,然后調節切片的厚度,一般為5µm,如果比較難切,則可以適當調整厚度,用毛筆將切割的載玻片向外拉,并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40°C溫水中。
4.撈組織:當組織載玻片置于40°C溫水中之前,要先將水浴中的氣泡趕走,以免氣泡受熱上浮而貼到組織上,組織受熱展開,zui好是組織不起皺紋,用載玻片撈組織時,一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張,其中2-3張是備用的,每張載玻片上通常撈兩份組織,做對照使用,這樣形成的誤差就比較小了,而且撈載玻片的時候zui好方向一致,以便觀察,再將撈出來的載玻片置于架子上,放入37°C溫箱中烘干。
5.脫蠟:依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,起脫蠟作用的主要是二甲苯,依據的是相似相溶的原理.一般在每個試劑中放10min,天氣熱可以少放幾分鐘,相反,天氣較冷的話,就要適當延長脫蠟時間,一般為12-15min.
6.抗原修復:脫蠟后在清水中沖洗一段時間,加入3%H2O2浸泡10min,從而除去內源性的過氧化氫酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗兩次,再加入檸檬酸緩沖液,放入微波爐中蒸煮3min(中火),一般剛到沸騰即可,冷卻至室溫,然后再蒸煮一次,冷卻至室溫,蒸煮的目的是為了使抗原的位點暴露出來。
7.血清封閉:冷卻至室溫后,將檸檬酸緩沖液倒掉,水洗2次,并將載玻片置于PBS中5min,洗2次,擦干組織周圍的PBS液,馬上加上血清,使一些非特異性的位點封閉起來,然后放入37°C溫箱中半小時。血清稀釋10倍(900µlPBS:100µl血清封閉液)。
8.加一抗:將溫箱中的載玻片取出,用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清,加一抗,如果做對照實驗,就在對照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過夜。

免疫組化實驗檢測

9.加二抗:將載玻片從冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上二抗,然后置于37°C溫箱中半小時。
10.加SABC: 將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍(990µlPBS:10µlSABC)。
11.加顯色劑: 將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。(顯色劑的配置:在1ml水中加1滴顯色劑A,搖勻,然后加1滴顯色劑B,搖勻,再加1滴顯色劑C,搖勻)   A:DAB        B:H2O2        C:磷酸緩沖液
12.復染: 將顯色后的片子用清水沖洗一段時間后,浸泡于蘇木精中染色,一般動物組織為半分鐘,植物組織3-5min。
13.脫水:將復染后的片子置于水中沖洗后,依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個試劑中放置2min,最后浸泡在二甲苯中,搬到通風柜中。
14.封片:用中性樹膠滴在組織旁邊,再用蓋玻片蓋上,要先放平一側,然后輕輕放下另一側,以免產生氣泡,封好片子后置于通風柜中晾干。
免疫組化的相關試劑:最重要的是選擇好一抗、二抗或者還有三抗,注意抗體的特異性、效價和交叉反應。

 

應用范圍:

1.病理診斷,如惡性腫瘤的診斷和分型; 

2. 觀察并比較組織內目的蛋白的分布情況;

3. 觀察并分析不同組織間目的蛋白表達和分布的差異化;  

4. 比較和分析目的蛋白在組織內的相對表達量;

5. 組織內目的蛋白的定性研究;

6. 組織形態觀察等。

 

實驗保證:

1. 完善的實驗服務流程

2.   資深的實驗員全程手工操作;

3. ding級期刊的圖像水準;

4.   真實客觀的實驗結果

5. 一路相伴的技術咨詢。

 

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